Forensische DNA-Analyse

The key to every biological problem must finally be sought in the cell. E.B. Wilson

Einleitung

Alec Jeffreys, ein englischer Wissenschaftler, wies 1985 Abschnitte nach, die bei jedem Menschen unverwechselbar und einmalig sind – abgesehen von eineiigen Zwillingen. Diese Entdeckung wurde zunächst kaum beachtet und erst später unter dem Begriff „genetischer Fingerabdruck“ bzw. „DNA-fingerprinting“ berühmt.

DNA ist die Abkürzung für das Erbgut im Zellkern. DNA steht im englischen für Desoxyribonucleic Acid, im deutschen für Desoxyribonukleinsäure. Die menschliche DNA besteht nur aus einem kleinen Anteil an Genen, der Rest ist der nicht-codierende Bereich. Bei der DNA-Analyse werden nur winzige Abschnitte aus dem informationslosen Teil bestimmt. Der Begriff „genetischer Fingerabdruck“ ist deswegen nicht ganz richtig, da keine Gene entschlüsselt werden, sondern sich die Analyse auf die 95 % der DNA beschränken, die keine Gene repräsentieren. Die restlichen 5 % bestehen aus funktionellen Einheiten, das sind jene Gene, die den Menschen charakterisieren, da dort wichtige Informationen codiert sind (Herbst, 1998; Wagner, 1993).

Die DNA-Analysen haben eine wichtige Stellung bei der Bearbeitung kriminalistischer Fragestellungen. Daher sind sie ein unverzichtbares Ermittlungsinstrument bei der Verfolgung schwerer Straftaten, insbesondere im Bereich der Sexualdelikte (Keller & Hülsmann, 2001).

Dabei ist besonders zu beachten, dass es für die Untersuchung nicht wichtig ist, ob es sich um Blut-, Epithelzellen oder Speichel handelt. Einer Auswertung können schon geringe Mengen von Spurenmaterial zugeführt werden.

Allgemeine biologische Grundlagen

Der Mensch besteht aus ungefähr 10 Milliarden Zellen. Dabei handelt es sich um kleine membranbegrenzte Einheiten, die mit Molekülen gefüllt sind. Zellen sind die kleinsten Funktionseinheiten des Körpers. Der Zellkern enthält die Erbinformation in Form doppelstrangiger DNA (Wagner, 1993). Jede Zelle beinhaltet DNA, darum hat jede Zelle (Blut, Haare, Speichel) den gesamten Bauplan gespeichert. In ausgezogenem Zustand wäre die gesamte DNA ca. zwei Meter lang. Diese muss aber so verpackt werden, um in einen um fünf Zehnerpotenzen kleineren Durchmesser hineinzupassen. Das Chromosom ist das Endprodukt der komplexen Verdichtung, welches der mikroskopisch sichtbare Träger der Erbanlage ist. Sie liegt fadenförmig im Zellkern vor. Jede Art von Lebewesen hat einen eigenen charakteristischen Chromosomensatz pro Zelle, den Karyotyp. Dieser besteht beim Menschen aus 46 Chromosomen, 23 davon vom Vater und 23 von der Mutter (Lenz, 1976). Durch Verschmelzung der Ei- und Samenzellen erhält das somit gezeugte Kind je einen einfachen Chromosomensatz (Herbst, 1998).

Was ist DNA?

DNA ist ein Doppelstrangmolekül. Eine elektronenmikroskopische Vergrößerung zeigt, dass ein langer Faden eine doppelt spiralisierte Form aufweist. Dieses fadenförmige Makromolekül besteht aus zahlreichen Desoxyribonucleotiden (Silverstein & Silverstein-Nunn, 2002).

Ein Nucleotid wiederum besteht aus einer stickstoffhaltigen Base, einem Zucker und einer oder mehreren Phosphatgruppen. Die einzelnen Bausteine werden regelmäßig verknüpft und ergeben ein strickleiterartiges Molekül (Butler, 2005; Herbst, 2001).

Das ca. zwei Meter lange Polymer besteht aus vier Bauteilen, nämlich den Basen Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin (Wagner, 1993). Diese Bauteile werden aus Desoxyribo-Phosphorsäurediester zu einem langen Strang verknüpft. Für gewöhnlich ist die OH-Gruppe am C-5 Atom des Zuckers mit einem oder mehreren Phosphorgruppen verästet. Dadurch entsteht ein Einzelstrang.

Wie wird Erbinformation auf den menschlichen Phänotyp übertragen?

Die Abfolge dieser vier Bauteile bestimmt den gesamten genetischen Bauplan. Jeweils drei Basen bilden die kleinste Informationseinheit. Sie kodieren für eine bestimmte Aminosäure. Demnach könnten mit vier Nucleotiden 64 Aminosäuren repräsentiert werden.

Verwendet werden aber nur 20 Aminosäuren, welche zu Proteinen (= Eiweißstoffen) umgewandelt werden. Proteine bilden den Aufbau- und den Betriebsstoff des menschlichen Körpers. Man hat sich auf eine Untersuchung von 20 solcher Abschnitte geeinigt. Diese stammen aus der Gruppe der „short tandem repeats“ (STR). Das sind Sequenzwiederholungen, die direkt aneinandergefügt sind, generell werden sie als tandem repeats bezeichnet. Dort wiederholen sich kleine, meist zwei bis vier Basen lange Abschnitte (Kernsequenzen) mehr oder weniger häufig.

Die Basen der Nukleinsäuren haben die Eigenschaft, dass sich T nur an A unter Bildung von zwei Wasserstoffbrückenbindungen und C nur an G unter Bildung von drei Wasserstoffbrückenbindungen anlagert. Die zwei Nucleinsäureketten werden als plektonemisch bezeichnet. Dies bedeutet, dass sich die beiden Stränge so verdrillen, sodass diese nicht ohne Aufdrehen getrennt werden können und strickleiterartig gestaltet sind (Janning & Knust, 2004; Knippers, R., Philippsen, P., Klaus, P. & Fanning, 1997).

Diese Strickleiter oder Doppelhelix wird auch als Watson-Crick-Helix bezeichnet und ist wie eine Wendeltreppe um sich selbst nach rechts spiralisiert.

Der Unterschied zwischen den codierenden und nicht-codierenden Bereichen der DNA

Nur bestimmte Abschnitte der Nucleotidsequenz haben genetische Funktionen und enthalten Informationen für die Bildung von Proteinen.

Daher unterscheidet man zwischen codierenden und nicht-codierenden Bereichen. Jener DNA-Abschnitt, der die Informationen zur Proteinherstellung trägt, wird als Gen bezeichnet. In den Genen gibt es sehr lange DNA-Abschnitte, die keine Funktion bzw. Aufgabe haben (= „junk DNA“). Nur 10 % der DNA besteht aus codierenden Sequenzen, der Rest gilt als nicht-codierend (Herbst, 1998). In diesem Bereich befindet sich keine Information über äußerliche Merkmale wie Alter, Haarfarbe usw.

Die nicht-codierenden Abschnitte benötigt man für die Anwendung der DNA-Analyse im Bereich des Strafrechts (Keller & Hülsmann, 2001). Es gibt Abschnitte innerhalb der nicht-codierenden Sequenzen, in denen sehr kurze Sequenzen mehrmals hintereinander geschalten auftreten. Diese Regionen werden als „variable number of tandem repeats-Regionen“ (VNTR) bezeichnet. Diese VNTRs verfügen über eine individuelle Musterung.

Die Untersuchung/Analyse der DNA kann im codierenden und nicht-codierenden Bereich stattfinden. Wenn man genetische Defekte feststellen will, muss man den codierenden Bereich untersuchen. Die Analyse der nicht-codierenden Abschnitte nimmt man für die Untersuchung verschiedener Materialien (wie beim Abgleich zwischen Verdächtigen und Tatortspur).

Methoden

Es gibt verschiedene Methoden eine DNA zu analysieren. Das RFLP-Verfahren kann das Spurenmaterial direkt charakterisieren, die PCR-Methode muss das Präparat mit Hilfe von Amplifikationsverfahren (Vermehrungsverfahren) qualitativ und quantitativ verbessern.

Das RFLP-Verfahren (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen)

1. Extraktion von genomischer (chromosomaler) DNA
2. Schneiden der DNA mittels Restriktionsenzymen
3. Southern-Blot-Analyse
4. Anlegen von spezifischen Sonden
5. Autoradiographie
6. Vermessung

Extraktion von genomischer (chromosomaler) DNA

Der erste Schritt der Charakterisierung von biologischem Material ist die „Aufreinigung“. Die Kern-DNA ist mit Proteinen zu Chromatin verdichtet. Die DNA muss aus dem Chromatin extrahiert werden. Das geschieht durch proteinverdauende Agentien, Salze und organische Lösungsmittel, wie Phenol und Chloroform.

Schneiden der DNA mittels Restriktionsenzymen

Große Moleküle lassen sich mittels Restrictionsendonucleasen (DNA-spaltende Enzyme) spalten. Diese erkennen bestimmte DNA-Sequenzen und trennen den DNA-Strang an spezifischen Stellen. Dadurch entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Längen. Die Anzahl und Länge der Fragmente variiert von Person zu Person.

Southern-Blot Analyse

Die Sortierung der DNA-Teile wird mit der Agarosegel-Elektrophorese gemacht. Die unterschiedlichen Längen der DNA-Teile wandern unterschiedlich schnell durch ein Gel. Sie sind aufgrund ihrer molekularen Struktur negativ geladen und durch diese elektrische Spannung bewegen sie sich von der Kathode zur Anode. Kleinere Fragmente sind schneller als größere. Die einzelnen Fragmente werden in Natronlauge (alkalische Lösung) denaturiert.

Beim „Southern Blottering“ werden DNA-Teile vom Gel auf eine Nylonmembran übertragen und genau an ihrer Gelposition mittels UV-Licht fixiert. Die Übertragung erfolgt durch einen Vakuum-Blotter.

Anlegen der spezifischen Sonden

Die fixierte DNA wird mittels einer Chemilumineszenz oder radioaktiv markierten Oligonnucleotidsonde inkubiert. Es entsteht ein kleines DNA-Molekül, das komplementär zur gewünschten Zielsequenz ist. Dabei ist es notwendig zu beachten, dass die Sonden markiert werden, um sie nach der Anlagerung nachweisen zu können. Nach der Hybridisierung muss durch einen Waschvorgang der Überschuss und alle unspezifisch gebundenen Sonden–DNA entfernt werden, weil sie die Sonden nicht nur an homologe membrangebundene Zielsequenzen binden.

Durch die DNA-Sonde ist eine Sichtbarmachung, der auf die Sonde passenden Fragmente möglich. Für die Kriminaltechnik sind hier zwei Methoden von Interesse:

1. Multi-locus-Sonde (mehrere Genloci gleichzeitig erkennbar)
2. Single-locus-Sonde (bindet nur an ein Genom [= Gesamtheit des DNA-Moleküls])

Vorteile der Single-locus-Sonde gegenüber der Multi-locus-Sonde:

• Sie ist wesentlich empfindlicher und somit für die Untersuchung von Spuren geeignet.
• Mischspuren können eindeutig identifiziert werden.
• Artefakte können sicher erkannt werden.

Autoradiographie

Die Membran wird danach mit einem Röntgenfilm belegt. Anschließend stellen sich die zur eingesetzten Sonde homologen Fragmente als dunkle Banden auf einem Film dar.

Vermessung

Zum Schluss werden die Blots vermessen und die Längen in Kilobasen angegeben. Alle Individuen einer Art weisen verschiedene Bandenmuster auf. Somit ist eine eindeutige Identifizierung möglich – einzige Ausnahme bilden eineiige Zwillinge.

Das PCR-Verfahren (Polymerase-Chain-Reaction)

1. Denaturierung
2. Annealing
3. Replikation

Denaturierung

Nicht immer ist die nötige Menge an DNA vorhanden, daher verwendet man eine andere Methode - die PCR-Methode. Diese relativ neue und effiziente Methode ermöglicht eine „in vitro Amplifizierung“ spezifischer Zielsequenzen der DNA. Hierzu werden nur eine Matrizen-DNA, Primer, Nucleotide, Puffer und eine DNA-Polymerase benötigt (Herbst 1998).

Die Doppelhelix muss als Einzelstrang vorliegen. Das geschieht durch Erhitzen auf 95°C und anschließendes, rasches Abkühlen (Hitzedenaturierung). Die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, werden gebrochen. Im ersten Durchgang wird die DNA oft längere Zeit erhitzt um sicherzustellen, dass sich sowohl die Ausgangs-DNA, als auch die Primer vollständig voneinander getrennt haben und nur noch Einzelstränge vorliegen. Gibt man DNA-Polymerase und geeignete Primer (= kurzer, synthetisierter DNA-Einzelstrang) hinzu, entsteht bei einer Reaktionstemperatur von 72 °C wieder ein Doppelstrang.

Annealing

Zu den Enden der Target-DNA (diese dient als Matrize) sind die Primer komplementär. Ihre 3-Enden sind gegeneinander gerichtet, weisen also nach innen über die gesamte interne DNA-Sequenz. Die Primer-Anlagerung gibt an, welche der vielen DNA-Stränge vervielfältigt werden soll. Wegen der vorgegebenen Sequenz der Primer können sich diese nur an die passenden Fragmente anlagern und somit die PCR einleiten.

Replikation

Die Replikation wird bei 72°C durchgeführt. Die DNA-Polymerase (= Enzym, das DNA-Stränge neu synthetisiert und die vorhandene DNA benutzt) verlängert nun die angefangenen DNA-Stränge. Das erfolgt durch den Einbau der Nukleotide in die DNA. Am Ende liegen zwei identische Doppelstränge vor.

Es sind also 3 Schritte für die Synthese nötig.

1. Hitzedenaturierung
2. Hybridisierung
3. Verlängerung der Stränge

Insgesamt führt man 30 bis 40 Zyklen durch. Bei jedem Zyklus kommt es zu einer Verdoppelung. Die originale DNA wird somit millionenfach amplifiziert. Um sie dann darstellen zu können, wird sie mittels Elektrophorese von den Primern abgetrennt (Brown, 2001; Krieglstein, 1994).

VOR- und NACHTEILE des PCR- gegenüber dem RFLP-Verfahren

Geringe Mengen an DNA oder auch stark degradierte DNA kann mittels PCR untersucht werden. Dafür genügt eine einzige Zelle. Die PCR funktioniert aber nicht bei größeren Molekülen. Für eine Analyse müsste das Ausgangsmaterial verdünnt werden. Interne und externe Qualitätskontrollen sind unerlässlich, aufgrund der relativ hohen Kontaminationsgefahr.

Eine verbesserte Methode der PCR, ist die Kapillar-Elektrophorese. Die Auftrennung der DNA erfolgt in den Kapillaren, nicht wie bei der PCR, in einem Gel. Die Kapillaren sind dabei mit Trennpolymeren (dient der Sortierung der DNA) gefüllt. Bei der Kapillar-Elektrophorese benötigt man zehn Primerpaare und einen Zyklus um ein Untersuchungsergebnis zu erhalten. Dadurch bekommt das Gericht schneller Untersuchungsergebnisse (Herbst, 1998).

Das DNA-Fingerprinting

Ein Täter hinterlässt vor allem bei Gewalt- und Sexualdelikten häufig Blut oder Sekret, also jene Spuren, die für den genetischen Fingerabdruck verwendet werden können. Durch einen Vergleich des gefundenen Spurenmaterials mit dem Zellmaterial kann man die Spur dem Verursacher zweifelsfrei zuordnen.

Spuren

Grundsätzlich ist eine Extrahierung der DNA aus jeder Körperzelle, die einen Zellkern enthält, möglich. Geeignetes Zellmaterial ist Blut, Speichel, Sperma, Vaginalsekret, Schweiß, Nasen- und Körpersekrete, Epithelzellen, Körpergewebe (Muskulatur, innere Organe, Knochen, Zähne), Haare und Haut.

Blut

Um Blut analysieren zu können, müssen genügend Leukozyten darin enthalten sein. Erythrocyten (= rote Blutkörperchen) enthalten keinen Zellkern, somit auch keine DNA. Für eine RFLP-Analyse werden ca. 0,2 ml Blut benötigt.

Sperma

Im Vergleich zum Blut enthält jede einzelne Spermazelle DNA. Um einen DNA-Fingerprint machen zu können, müssen ca. 200.000 Spermaköpfe vorhanden sein. In der Praxis benötigt man für eine RFLP-Analyse 500 ng, für eine PCR 1-3 ng Sperma.

Speichel und Haare

Für eine Analyse von Speichel ist eine größere Menge erforderlich, da nur Zellpartikel untersucht werden können. Speichelreste auf einer Zigarette reichen für das RFLP-Verfahren nicht aus, eine PCR kann sehr wohl durchgeführt werden.

Bei natürlich ausgefallenen Haaren ist das Zellmaterial meist bereits abgestorben, daher ist eine Analyse eher selten möglich.

Probleme mit dem Spurenmaterial

Große DNA-Moleküle sind empfindlich, kurze Abschnitte hingegen sehr stabil. Umwelteinflüsse können den Abbau des DNA-Moleküls bewirken. Enzyme können das Molekül in kleine Stücke zerlegen und eine Untersuchung des Spurenmaterials ist nicht mehr möglich. Besonders schlecht wirken sich Hitze, Feuchtigkeit und Farbstoffe aus.

Stark degradierte DNA kann mittels PCR-Verfahren extrahiert werden, für Mischspuren ist das RFLP-Verfahren besser geeignet.

Rechtliche Grundlage

Seit 1990 ist der genetische Fingerabdruck nach den Vorschriften der StPO von Beschuldigten zulässig. Durch unterschiedliche Gesetze sind die Verwendung des genetischen Fingerabdruckes und die strafprozessualen Voraussetzungen für die Gewinnung dessen, seit 1997 erweitert und präzisiert worden (§§ 81 a, 81 c-h StPO).

Die DNA-Analyse darf nur zur Feststellung der Abstammung und der Herkunft des Spurenmaterials vom Beschuldigten oder vom Verletzten und zur Feststellung des Geschlechts dienen (§ 81 e StPO). Der genetische Fingerabdruck als einziger Beweis und eine daraus resultierende Verurteilung ist nicht zulässig. Weitere Beweise müssen vorliegen. Um die Identität festzustellen, ist eine Entnahme von Körperzellen und eine DNA-Analyse auch bei Personen, die einer erheblichen Straftat verdächtig sind und bei denen Wiederholungsgefahr besteht ebenfalls zulässig (§ 81 g StPO). In einer DNA-Identifizierungsdatei (DAD = DNA-Analyse-Datei) werden Daten seit 1998 gespeichert. Im Bußgeldverfahren ist eine Erstellung des genetischen Fingerabdruckes in nicht zulässig.

In der Bearbeitung kriminalistischer Fragestellungen haben die DNA-Analysen mittlerweile eine große Bedeutung. Sie wurden zu einem unverzichtbaren Ermittlungsinstrument, vor allem bei der Verfolgung von schweren Straftaten, insbesondere im Bereich der Sexualdelikte. Durch die DNA-Analyse haben Tatortspuren einen hohen Stellenwert bekommen. Die Grundsätze der Spurensuche und der Spurensicherung sind jedoch zwingend zu beachten. Dabei hängt der kriminalistische Erfolg erheblich von der Spurensicherung ab.

Literatur

Brown, T. A. (2001). Gene Cloning and DNA Analysis. An Introduction. Blackwell Publishing.

Butler, J. M. (2005). Forensic DNA Typing. Elsevier: Academic Press.

Herbst, S. (1998). Der “genetische Fingerabdruck”. Die DNA-Analyse als Hilfsmittel zur Täteridentifikation im österreichischen Strafverfahren. Dissertation, Paris-Lodron-Universität Salzburg.

Ganten, D. & Ruckpaul, K. (2007). Grundlagen der molekularen Medizin. Springer.

Janning, W. & Knust, E. (2004). Genetik: Allgemeine Genetik, Molekulare Genetik, Entwicklungsgenetik. Thieme Verlag.

Keller, C. & Hülsmann, U. (2001). Der genetische Fingerabdruck. Stuttgart: Richard Boorberg Verlag.

Knippers, R., Philippsen, P., Klaus, P. & Fanning, E. (1997). Molekulare Genetik. Stuttgart.

Krawzak, M. & Schmidtke, J. (1994). DNA-Fingerprinting. Heidelberg.

Krieglstein, M. (1994). Der genetische Fingerabdruck zur Personenidentifizierung im Strafverfahren: Zur Frage des gesetzgeberischen Handlungsbedarfs. Felix Verlag.

Lenz, W. (1976). Medizinische Genetik. Thieme Verlag: Stuttgart

Silverstein, A. & Silverstein-Nunn, L. (2002). DNA. Twenty-First Century Books.

Wagner, U. (1993). Das “genetische Fingerabdruckverfahren” als Hilfsmittel bei der Verbrechensbekämpfung. Dissertation, Eberhard-Karls-Universität zu Tübingen.

Links

• President's DNA Initiative. http://www.dna.gov/info/ (27.11.08)